慢病毒包装系统通常包括几个质粒，这几个质粒上分别含有慢病毒复制的成分。第二代慢病毒包装系统含有3个质粒，包括1个包装质粒(psPAX2)、1 个包膜质粒(pMD2G)、1个目的基因质粒和1株包装细胞(293T cell)。
图1. 2代慢病毒包装系统的示意图
慢病毒包装流程
首先，辅助质粒pMD2G、含目的基因的穿梭质粒、辅助质粒psPAX2进行三质粒共转染到293T细胞中，宿主基因组表达时，随宿主基因转录出的目的基因RNA与psPAX2和pMD2G翻译出的蛋白组装为慢病毒。转染72h后收取上清培养基，滤膜过滤后加入超速离心管离心，收集病毒分装，进行病毒滴度测定和特异性检测。
图2. 慢病毒包装流程图
慢病毒的纯化
采用蔗糖密度梯度超速离心法对慢病毒进行纯化。它利用不同颗粒之间存在的沉降系数差，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带。
图3. 慢病毒纯化的示意图
慢病毒滴度检测
含荧光标记的慢病毒可以通过孔稀释法进行滴度测定，孔稀释法得到的结果为有感染能力的慢病毒颗粒数,可根据荧光蛋白在HEK293细胞中表达量确定。将病毒依次稀释，做8个稀释度（10~10E-6），每个稀释度重复3个孔，分别感染预先准备好的细胞，用荧光显微镜对荧光阳性细胞进行计数，数出最后两个能观察到荧光的孔内的荧光细胞数，计算3个重复孔内的总数之和并计算平均数，假设为A（倒数第二个能见荧光孔的荧光细胞平均数）和B（倒数第一个能见荧光孔的荧光细胞平均数）。
慢病毒滴度计算公式：病毒滴度（TU/mL）=（A+B×10）×1000/2/A孔病毒量（μL）返回搜狐，查看更多