大家好，今天跟大家分享一篇厦门大学团队近期发表在 Advanced Sciences上的Methuosis Inducer SGI-1027 Cooperates with Everolimus to Promote Apoptosis and Pyroptosis by Triggering Lysosomal Membrane Permeability in Renal Cancer 团队首次发现并证明了DNA甲基转移酶1（DNMT1）抑制剂SGI-1027能够在肾癌细胞中诱导细胞空泡化和巨泡式死亡，而且SGI-1027与mTOR抑制剂依维莫司联合使用能够抑制肾癌细胞的生长、迁移和侵袭，其机制涉及溶酶体膜通透性（LMP）增加，触发细胞凋亡和GSDME依赖的焦亡。
01
研究背景
mTOR 抑制剂依维莫司已被批准作为肾细胞癌 （RCC） 的序贯或二线治疗。然而，耐药性的发展限制了其临床应用。本研究旨在解决依维莫司耐药的挑战，并为晚期 RCC 的治疗提供新的见解。在这里，首次发现并证明了 DNA 甲基转移酶 1 （DNMT1） 抑制剂 SGI-1027 在诱导细胞空泡化和细胞液泡中毒中的细胞毒性。
此外，SGI-1027 与依维莫司发挥协同作用，因为它们的组合抑制了肾癌细胞的生长、迁移和侵袭。从机制上讲，观察到溶酶体膜通透性 （LMP） 触发的细胞凋亡和 GSDME 依赖性焦亡。肾癌细胞中 GSDME 表达的上调和溶酶体活性的增加为这两种药物联合治疗肾癌提供了治疗窗口。
联合治疗表现出有效的抗肿瘤活性，并且在皮下肿瘤模型中具有良好的耐受性。总体而言，本研究验证并揭示了 SGI-1027 的特异性细胞毒性特性及其与依维莫司的强大协同作用，为先进的 RCC 治疗和克服依维莫司耐药性提供了新的见解。
见图一
SGI-1027 通过巨胞饮作用在肾癌细胞中诱导液泡。
图一
（A–D） 半数最大抑制浓度 （IC50） 通过非线性回归计算 786-O、A-498、Caki-1 和 HK-2 细胞中 SGI-1027。786-O、A-498、Caki-1 和 HK-2 细胞用指定浓度的 SGI-1027 处理 48 h。
（E） HK-2、786-O、A-498 和 Caki-1 细胞用 1 × 10 处理−6 m 或 2 × 10−6 m SGI-1027 24 小时，并在显微镜下捕获活细胞图像。
（F） 786-O 和 A-498 细胞的荧光素黄染色。786-O 和 A-498 细胞用 1.5 × 10 处理−6 m SGI-1027 和 2 毫克 mL−1荧光素黄 24 h。
G） 786-O 和 A-498 细胞用 1.5 × 10 处理−6 m SGI-1027 24 小时，然后与 Lyso-Tracker、Mito-Tracker 和 ER-Tracker 孵育 30 分钟。Hoechst 用于细胞核的特异性染色。
（H） 1.5 × 10 处理的 786-O 和 A-498 细胞中 Rab7、LAMP1 和 LAMP2 的免疫荧光染色−6 m SGI-1027 24 小时。
见图二
SGI-1027 诱导的细胞毒性涉及肾癌细胞中的中毒性。
图二
（A） 786-O 细胞用 1.5 × 10 处理−6 m SGI-1027 24 小时，然后在制备细胞切片后在透射电子显微镜下观察。绿色和紫色箭头分别表示内质网和线粒体。
（B） 活细胞图像，说明 SGI-1027 诱导的空泡化，独立于细胞凋亡、自噬或坏死。786-O 细胞用 1.5 × 10 处理−6 m SGI-1027,50 × 10−6 m Z-VAD-FMK，1 × 10−3 m 3-MA，50 × 10−6 m necrostatin-1 或其组合，指示 24 小时。
（C） 显示 PARP 和裂解 PARP （Cl-PARP） 表达的典型蛋白质印迹。786-O 和 A-498 细胞用指定浓度的 DMSO（对照）、SGI-1027 或 10 × 10 处理−6 m 顺式二氨基二氯铂 （CDDP，阳性对照） 48 h。Western blot 检测 PARP 和裂解的 PARP （Cl-PARP），β-肌动蛋白作为上样对照。
（D） 为了验证 SGI-1027 与细胞凋亡之间的关系，用 50 × 10 预处理 786-O 细胞−6 m Z-VAD-FMK 2 小时，然后用 2 × 10 处理−6 m SGI-1027 或 10 × 10−6 m 顺式 - 二氨基二氯铂（CDDP，阳性对照）48 小时。为了验证 SGI-1027 与自噬或坏死之间的关系，用 2 × 10 处理 786-O 细胞−6 m SGI-1027,1 × 10−3 m 3-MA，50 × 10−6 M Necrostatin-1 或其组合，如图所示 48 小时。CCK-8 法检测细胞活力。NS，不显著;**P < 0.01;P < 0.0001。
（E，F） 786-O 细胞用 2 × 10 处理−6 m SGI-1027 指定时间或用 SGI-1027 以指定浓度处理 24 小时。Western blot 检测 LC3B，以 GAPDH 为上样对照。
见图三
SGI-1027 和依维莫司协同抑制肾癌细胞的增殖。
图三
（A） 依维莫司促进 SGI-1027 诱导的肾癌细胞空泡化。786-O 和 A-498 细胞用 DMSO （对照）、5 × 10 处理−6 M 依维莫司，1.5 × 10−6 m SGI-1027 及其组合 12 小时。
（B） 协同评分模型证明 SGI-1027 和依维莫司的协同作用。用不同浓度的 SGI-1027 和依维莫司处理 786-O 和 A-498 细胞，或如图所示将它们的组合处理 24 小时。随后，通过 Synergyfinder 软件根据细胞活力构建协同评分模型。
（C） CCK-8 测定法检测经 DMSO（对照）处理的 786-O 和 A-498 细胞（对照）的细胞增殖，5 × 10−6 M 依维莫司，1.5 × 10−6 m SGI-1027 或它们的组合。
（D） EdU 检测，用于标记处于 DNA 合成状态的细胞。786-O 和 A-498 细胞用 DMSO （对照）、5 × 10 处理−6 M 依维莫司，1.5 × 10−6 m SGI-1027，或它们的组合在 EdU 染色前 24 小时。
（E） SGI-1027 和依维莫司对肾癌细胞细胞周期的协同作用。786-O 和 A-498 细胞用 DMSO （对照）、5 × 10 处理−6 M 依维莫司，1.5 × 10−6 m SGI-1027，或它们的组合，在碘化丙啶 （PI） 染色和流式细胞术分析前 24 小时。NS，不显著;*P < 0.05;**P < 0.01;P < 0.001;P < 0.0001。永远，依维莫司;国际创价学会，SGI-1027;COMB，SGI-1027 联合依维莫司。
见图四
SGI-1027 和依维莫司协同抑制肾癌细胞集落形成、迁移和侵袭。
图四
（A） 检测肾癌细胞增殖能力的集落形成测定。786-O 和 A-498 细胞与 DMSO （对照） 孵育后用结晶紫染色，1 × 10−6 M 依维莫司，1 × 10−6 m SGI-1027，或它们的组合 14 天。
（B） 伤口愈合试验和 C） 检测肾癌细胞迁移的 transwell 迁移试验。786-O 和 A-498 细胞用 5 × 10 处理−6 M 依维莫司，1.5 × 10−6 m SGI-1027，或它们的组合在每次测定中持续 24 小时。
（D） 检测肾癌细胞侵袭的 Transwell 侵袭试验。786-O 和 A-498 细胞用 DMSO （对照）、5 × 10 处理−6 M 依维莫司，1.5 × 10−6 m SGI-1027，或它们的组合 48 小时。**P < 0.01;P < 0.001;P < 0.0001。永远，依维莫司;国际创价学会，SGI-1027;COMB，SGI-1027 联合依维莫司。
见图五
SGI-1027 与依维莫司合作诱导细胞凋亡和 GSDME 依赖性焦亡。
图五
（A） 用 DMSO（对照）处理的 786-O 细胞的透射电子显微镜成像，5 × 10−6 M 依维莫司，1.5 × 10−6 m SGI-1027，或它们的组合 24 小时。
（B） 膜联蛋白 V 和碘化丙啶 （PI） 对用 DMSO（对照）处理的 786-O 和 A-498 细胞进行染色，10 × 10−6 m 依维莫司，不同浓度的 SGI-1027 及其组合如图所示。
（C） LDH 释放试验检测用 DMSO 处理的肾癌细胞（对照）的 LDH 释放，5 × 10−6 M 依维莫司，1.5 × 10−6 m SGI-1027 或它们的组合。
（D） 用 DMSO（对照）、5 × 10 处理 A-498 细胞−6 M 依维莫司，2 × 10−6 m SGI-1027 或它们的组合 24 h。Western blot 检测 PARP 、裂解的 PARP （Cl-PARP）、GSDME、GSDMD，以 GAPDH 作为上样对照。
（E） 用 5 × 10 的组合处理 A-498 细胞−6 M 依维莫司和 2 × 10−6 m SGI-1027 指定时间。Western blot 检测 PARP 、 裂解的 PARP 、 GSDME 、 pro-Caspase 3 、 裂解的 Caspase 3 （Cl-Caspase 3）。以 GAPDH 作为上样对照。P < 0.001;P < 0.0001。永远，依维莫司;国际创价学会，SGI-1027;COMB，SGI-1027 联合依维莫司。
见图六
RNA 测序分析揭示了协同效应与溶酶体之间的关联。
图六
（A） 依维莫司组、SGI-1027 组和 SGI-1027 与依维莫司组结合的火山图。
（B） 依维莫司组、SGI-1027 组和 SGI-1027 联合依维莫司组中上调或下调 DEGs 的维恩图。
（C，D） 上调 DEGs、C） 和下调 DEGs、D） 组合组特有的 GO 和 KEGG 富集分析。BP，生物过程;CC， 细胞成分;MF，分子功能;KEGG，京都基因和基因组百科全书。
（E） 对照组 （DMSO） 、依维莫司、SGI-1027 和联合治疗组中焦亡相关基因表达的热图。
（F） 联合组中与细胞噬噬和溶酶体相关的基因集的 GSEA 富集分析。ES，富集评分;NES，标准化富集评分。永远，依维莫司;国际创价学会，SGI-1027;COMB，SGI-1027 联合依维莫司。
02
研究结论
综上所述，本研究首次确定 SGI-1027 是 RCC 中的梅曲病诱导剂，SGI-1027 联合依维莫司可通过诱导 LMP 对 RCC 细胞产生强大的致死作用，为治疗晚期 RCC、依维莫司耐药以及 GSDME 阳性恶性肿瘤提供了新的解决方案。
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