细胞是机体中的一个个微观世界，这个微观世界通过几十条细胞信号通路沟通来维持生命机体的稳态和生长。而在这几十条信号通路中，只有2条使用了动物来命名，今天我们就来先了解下其中之一的河马信号通路以及这条通路的蛋白秘密。
大纲
1. 河马通路起源
2. 河马通路机制
3. 河马通路的生理及病理作用
4. 河马信号通路家族主要成员及其检测特点
1 河马信号通路（Hippo Signaling Pathway）
河马信号通路（Hippo Signaling Pathway），简称河马通路或Hippo通路，首次发现于黑腹果蝇中。其关键组成成员蛋白激酶Hippo突变能使组织增生，果蝇会出现一个巨大的头部[1]，而且脖子上会出现褶皱的形状，看上去像河马，河马通路因此而得名。
图1：Hippo/MST突变导致苍蝇头部和小鼠肝脏变大（图源：参考文献1）
在哺乳动物中，Hippo信号通路上游的膜蛋白受体感受到胞外环境的生长抑制信号后，经过一系列激酶的磷酸化反应，最终作用于下游效应因子YAP和TAZ。YAP和TAZ继而与细胞骨架蛋白相互作用，被滞留在胞质内，不能进入细胞核行使其转录激活功能，从而实现对器官大小和体积的调控。
2 Hippo信号通路组成部分
Hippo信号通路组成部分主要分为核心激酶的级联反应，上游多重信号的输入以及下游靶基因的转录调控等三个部分。
2.1 核心激酶的级联反应
Hippo信号通路的核心由一个高度保守的丝氨酸/苏氨酸激酶级联组成，该级联负调控转录共激活因子YAP和TAZ的表达和活性。在哺乳动物中，参与该通路的核心激酶包括哺乳动物ste20样蛋白激酶1 (MST1)、MST2、大肿瘤抑制因子1 (LATS1)和LATS2[2,3]。这些激酶的活性也依赖于它们与支架蛋白的相互作用。萨尔瓦多同源物1 (SAV1)与MST1/2形成复合物，而MOB激酶激活物1A (MOB1A)和MOB1B与LATS1/2相互作用[4]。
Hippo信号传导的核心由一组激酶（MST1/2和LATS1/2）和衔接蛋白SAV1和MOB1组成，它们通过磷酸化效应分子YAP和TAZ，将它们保留在细胞质中或者非磷酸化的YAP和TAZ可以易位至细胞核调节几种转录因子的活性，参与器官大小控制、组织再生和癌症发展[5,6]。
图 2 Hippo信号通路的开启和关闭状态（图源：参考文献5）
（左）当Hippo信号转导开启时，LATS1/2磷酸化YAP/TAZ，导致β-TrCP E3连接酶介导的YAP/TAZ降解。另外，由于YAP/TAZ的磷酸化为14-3-3创造了结合位点，YAP/TAZ与14-3-3在这些位点上的相互作用促进了YAP/TAZ在细胞质中的滞留。（右）当Hippo信号转导失活时，细胞质中的YAP/TAZ可以易位至细胞核中，并在其积累后与TEAD转录因子（TEAD1-TEAD4）相互作用，诱导 YAP/TAZ 靶基因的表达。
2.2 上游多重信号的输入
Hippo 信号通路中MST-LATS激酶级联的磷酸化事件受到上游多种信号调节，包括：可溶性因子、细胞极性、细胞密度、应激信号、机械信号[7,8]。
图 3 Hippo通路的上游多重信号调节（图源：参考文献7）
(1) 可溶性因子
G蛋白偶联受体 (GPCR) 构成哺乳动物可溶性因子最大的膜受体家族，Hippo通路已被证明受GPCR信号传导调节。例如，凝血酶或溶血磷脂酸(LPA)等GPCR配体可以激活成纤维细胞中的YAP，使其对TGF-β1敏感。此外，鞘氨醇-1-磷酸(SIP)是GPCR的配体，可诱导YAP的核定位，促进YAP靶基因在小鼠胚胎细胞和肝细胞中的表达。除了凝血酶、LPA和S1P外，大量可溶性因子已被证明通过与GPCR相互作用来调节Hippo通路，如凝血酶或溶血磷脂酸(LPA)雌激素、内皮素、血管紧张素、前列腺素等。其中GPCR激活或抑制LATS1/2取决于Gα蛋白类型引起YAP的激活。
(2) 细胞极性
细胞极性是Hippo通路的关键调节因子，指细胞形状和结构的独特空间特征，包括顶基极性（AP）（将质膜分为顶端结构域和基底结构域） 和平面细胞极性（PCP）。顶基细胞极性复合物，如肿瘤抑制因子Merlin/神经纤维瘤2（Mer/NF2）（位于顶端结构域）和SCRIBBLE（位于基底结构域的膜蛋白），可将YAP/TAZ隔离在细胞质中。另外，顶端和基底结构域由细胞连接复合物（如AMOT和α-catenin）物理分离，AMOT家族蛋白（AMOT、AMOTL1和AMOTL2）可直接与YAP和TAZ结合，在紧密连接处隔离它们并抑制它们的转录活性，还可通过 LATS1/2途径间接调节YAP/TAZ；α-Catenin是E-cadherin-catenin复合物的重要组成部分，其功能对粘附体连接的完整性至关重要，α-Catenin可以抑制YAP的核定位。平面细胞极性受原钙粘蛋白脂肪（Ft）和 Dachsous的调节，它们参与Hippo通路的调节。
(3) 细胞密度
单层培养物中细胞的增殖率与细胞密度呈负相关。哺乳动物细胞的高度汇合会导致LATS的激活以及YAP的磷酸化和失活。细胞密度可以通过包括AMOT的Crumbs 复合物来感应，Crumbs 复合物与YAP/TAZ相互作用并促进其磷酸化后隔离在细胞质中；KIRREL1是一种细胞粘附分子，可以直接与SAV1结合以激活Hippo通路，在哺乳动物细胞中充当Hippo通路的反馈调节因子。Hippo通路的其他细胞密度递质包括E-cadherin、annexin A2和极性调节激酶PAR1b。
(4) 应激信号
细胞应激，如缺氧、内质网 (ER) 应激、能量应激、渗透应激或热应激，可以作为Hippo通路的上游信号，随后调节细胞的行为、生存和代谢。例如，在上皮性卵巢癌细胞中，1% O2或缺氧条件会下调YAP磷酸化(S127)，而上调TAZ磷酸化(S69)，从而不同程度地调节YAP和TAZ的活性；在人肝细胞癌细胞中，ER应激可通过促进GADD34/PP1 复合物的结合来抑制YAP的活性并增强细胞凋亡；AMPK是一种能量应激传感器，能量应激可诱导AMPK依赖性的LATS活化并导致YAP磷酸化。渗透应激诱导YAP在Ser128位点被Nemo样激酶（NLK）磷酸化，然后干扰其与14-3-3的结合，导致YAP核积累和激活。热应激通过与HSP90和PPP5相互作用抑制LATS激酶，从而激活 YAP/TAZ 诱导热休克转录组。
(5) 机械信号
机械信号是细胞感知其微环境的重要信号，不同的机械信号（如细胞外基质（ECM）刚度、细胞几何形状、液体流动力、张力和粘附）参与了Hippo通路的上游调控。如Rho、jub和Ajuba LIMD1，参与细胞从张力和附着到Hippo通路的传递；另外，整合素、peizo和plexin可以作为机械传感器蛋白向Hippo通路传递信号。
2.4 下游靶基因的转录调控
YAP/TAZ通过与其他DNA转录因子相互作用来识别一些顺式调控元件，调节靶基因表达，介导了Hippo通路的主要基因调控和生物学功能[9]。其中，TEAD1-4是YAP/TAZ主要靶向的转录因子，YAP/TAZ-TEAD复合物参与细胞增殖、生长和存活的靶基因启动子结合, 包括CYR61、CTGF、AREG、BIRC5等，其中，CYR61(也称为CCN1)和CTGF(也称为CCN2)是典型的YAP/TAZ靶基因，属于富含半胱氨酸的分泌蛋白家族(CCN家族)，调节多种生物过程，如细胞迁移、细胞增殖和细胞粘附[9]。另外，VGLL家族蛋白VGLL4可与YAP竞争性结合TEADs，影响TEAD靶基因的表达[10]。虽然TEAD因子是YAP/TAZ主要的相互作用伙伴，但YAP/TAZ还与其他DNA结合转录因子相互作用，如p73、RUNX53和TBX5等[11]，即YAP/TAZ与多种转录因子协同调控靶基因的表达。
另外，YAP/TAZ与TEAD转录因子结合，与染色质重塑因子相互作用并调节RNA聚合酶II (Pol II)来驱动或抑制靶基因的表达，其中主要包括细胞周期（其靶基因主要有MCM3, MCM6，CDK1，POLA1）、细胞迁移（其靶基因主要有RHOA，CDC42，RAC1等）和细胞的干性（其靶基因包括四种多能因子SOX2、NANOG、OCT4(也称为POU5F1)和MYC）。
图 4 下游靶基因调控（图源：参考文献11）
3 Hippo信号生理及病理作用
YAP/TAZ是Hippo通路的关键下游效应子，可易位到细胞核以诱导TEAD介导的与细胞生长和增殖相关的基因的表达。Hippo通路效应子YAP/TAZ可以参与多种细胞事件的调节，包括增殖、凋亡、分化和生长，从而参与 胚胎发生和发育 、 组织/器官再生和伤口愈合 等 生理过程 [7] 。
3.1 Hippo通路的关键生理功能
图 5 Hippo通路的基本生理功能（图源：参考文献7）
胚胎发生和发育：例如，在桑葚胚中，Hippo通路在细胞内处于高激活状态，而Hippo通路在细胞外处于低激活状态，以维持植入前期外上皮滋养外胚层和内细胞团的正常发育。
组织/器官再生：例如，YAP 激活可以诱导成年小鼠的心脏再生。
伤口愈合：例如，YAP/TAZ 的激活和核定位在伤口愈合过程中促进上皮细胞的增殖。
3.2 Hippo通路失调与人类疾病
图 6 Hippo通路失调引起的疾病（图源：参考文献7）
Hippo通路作为调控细胞增殖、分化和存活的信号通路，在器官的发育和稳态中起着至关重要的作用。因此，Hippo通路的失调会导致多种疾病，包括癌症、眼病、心脏病、肺病、肾病、中枢神经系统疾病、肝病和免疫功能障碍等。
癌症：如YAP在结直肠肿瘤生长中起抑制作用。
眼病：如MST2缺陷可以防止光感受器细胞在视网膜脱离后死亡。
心脏病：如缺血性或非缺血性心力衰竭样本中的p-YAP和p-LATS增加。
肺病：如MST1/2 是一种通常起抗增殖作用的Hippo成分，通过BUB3支持肺动脉高压中PASMCs的异常增殖。
肾病：如多囊肾病是主要由PKD1或PKD2突变导致YAP和TAZ激活引起的遗传性疾病。
中枢神经系统疾病：如激活的Hippo通路可导致Aβ42诱导的神经细胞死亡。
肝病：如酒精性肝炎中YAP水平在肝细胞中升高。
免疫功能障碍：如Mst1-Mst2缺失导致自身免疫性疾病。
4 Hippo信号通路家族主要成员及其检测特点
Hippo信号通路是一个错综复杂、高度动态的网络，信号通路通过信号分子的共用、磷酸化级联的相互调节、以及正负反馈调控等机制参与细胞的生理活动中。在研究Hippo信号通路时，通路活性以及蛋白状态都会影响最终的实验数据，对蛋白的了解程度、合适的细胞刺激条件，正确的样本处理以及高特异性的抗体就显得尤其重要了。
通常我们会使用免疫印迹（western blot）来检测特定蛋白质及其修饰状态（如磷酸化）来评估信号通路活性，或者使用免疫沉淀（IP/Co-IP）研究蛋白互相作用，来了解信号通路中蛋白复合体的功能。接下来，我们就对河马通路的主要蛋白以及这些蛋白的特性做一个介绍。
4.1 YAP和TAZ
YAP和TAZ是两种结构和功能相似的转录共激活因子，是Hippo信号通路的关键下游调控靶点。当Hippo信号打开时，LATS1/2磷酸化YAP1/TAZ，使其在细胞质中积累，随后被泛素化-蛋白酶体降解[12]；当Hippo通路关闭时，YAP/TAZ未被磷酸化进入到细胞核中，与DNA转录因子结合，促进靶基因的表达。
检测推荐：
①信号通路蛋白通常提取的是总蛋白来研究总蛋白和磷酸化蛋白的趋势，为了避免磷酸化蛋白的去磷酸化，在提取这类蛋白时务必同时添加蛋白酶抑制剂及磷酸酶抑制剂。
②选择合适的靶标蛋白抑制剂/激动剂或者刺激条件达到预期检测结果。
多种细胞裂解液的WB检测YAP1兔多抗（13584-1-AP）稀释度：1:10000
YAP及TAZ研究相关好物推荐
抗体
酶抑制剂
抑制剂/激动剂（靶向YAP/TAZ-TEAD复合物）
MST1和MST2
MST1和MST2（哺乳动物Ste2样激酶，Hippo同源）是重要的激酶，主要参与调控细胞的生长、存活和凋亡等多种生物过程。二者形成复合物参与Hippo信号通路，通过与LATS1/2（下游效应子）相互作用来激活Hippo通路，从而进一步调节YAP/TAZ（转录因子）活性。MST1和MST2还与多种其他信号通路交互，如PI3K/Akt通路和MAPK通路，这些交互能够进一步调节细胞的生长和存活。
检测推荐：
①信号通路蛋白通常提取的是总蛋白来研究总蛋白和磷酸化蛋白的趋势，为了避免磷酸化蛋白的去磷酸化，在提取这类蛋白时务必同时添加蛋白酶抑制剂及磷酸酶抑制剂。
②选择合适的靶标蛋白抑制剂/激动剂或者刺激条件达到预期检测结果。
多细胞及多组织裂解液的WB检测MST1 兔多抗（22245-1-AP）稀释度：1:3000
MST1及MST2研究相关好物推荐
抗体
抑制剂/激动剂（靶向 MST1/MST2）
LATS1 和LATS2
LATS1 和LATS2 （大型肿瘤抑制激酶1/2，WTS同源）最重要功能之一是抑制YAP和TAZ。激活的LATS1/2通过磷酸化YAP和TAZ，促使它们与14-3-3蛋白结合，从而使其留在细胞质中，防止其转运到细胞核内。LATS1和LATS2通过抑制YAP和TAZ的活性来限制细胞的增殖和生长。
检测推荐：
①信号通路蛋白通常提取的是总蛋白来研究总蛋白和磷酸化蛋白的趋势，为了避免磷酸化蛋白的去磷酸化，在提取这类蛋白时务必同时添加蛋白酶抑制剂及磷酸酶抑制剂。
②选择合适的靶标蛋白抑制剂/激动剂或者刺激条件达到预期检测结果。
sh-Control and sh-LATS1 transfected HepG2细胞的WB检测LATS1
LATS1及LATS2研究相关好物推荐
抗体
抑制剂/激动剂（靶向 MST/LATS）
目前已经有许多研究表明Hippo通路的几种组分与多种疾病有关，如MST1/2与免疫应答有关，LATS1/2与癌症免疫力有关，而YAP/TAZ是人类恶性肿瘤中普遍激活的高度相关的转录调节因子，在多种癌症中均被激活，并促进肿瘤的发生、生长、转移和耐药性。因此，靶向Hippo途径极具吸引力。
Proteintech专注抗体研发生产二十余年，可提供兔多抗，小鼠单抗，重组兔单抗等3万+抗体，高效协助科研学者选择合适的抗体，做对实验第一步，高效完成相关课题研究。
下一期，我们会介绍另一个以动物命名的信号通路，你能猜到是哪个吗？
参考文献
[1] Halder G, Johnson RL. Hippo signaling: growth control and beyond. Development. 2011 Jan;138(1):9-22.
[2] Harvey KF, Pfleger CM, Hariharan IK. The Drosophila Mst ortholog, hippo, restricts growth and cell proliferation and promotes apoptosis. Cell. 2003 Aug 22;114(4):457-67.
[3] Wu S, Huang J, Dong J, Pan D. hippo encodes a Ste-20 family protein kinase that restricts cell proliferation and promotes apoptosis in conjunction with salvador and warts. Cell. 2003 Aug 22;114(4):445-56.
[4] Tapon N, Harvey KF, Bell DW, Wahrer DC, Schiripo TA, Haber D, Hariharan IK. salvador Promotes both cell cycle exit and apoptosis in Drosophila and is mutated in human cancer cell lines. Cell. 2002 Aug 23;110(4):467-78.
[5] Juan WC, Hong W. Targeting the Hippo Signaling Pathway for Tissue Regeneration and Cancer Therapy. Genes (Basel). 2016 Aug 30;7(9):55.
[6] Yu FX, Zhao B, Guan KL. Hippo Pathway in Organ Size Control, Tissue Homeostasis, and Cancer. Cell. 2015 Nov 5;163(4):811-28.
[7] Fu M, Hu Y, Lan T, Guan KL, Luo T, Luo M. The Hippo signalling pathway and its implications in human health and diseases. Signal Transduct Target Ther. 2022 Nov 8;7(1):376.
[8] Juan WC, Hong W. Targeting the Hippo Signaling Pathway for Tissue Regeneration and Cancer Therapy. Genes (Basel). 2016 Aug 30;7(9):55.
[9] Moya IM, Halder G. Hippo-YAP/TAZ signalling in organ regeneration and regenerative medicine. Nat Rev Mol Cell Biol. 2019 Apr;20(4):211-226.
[10] Cai J, Choi K, Li H, Pulgar Prieto KD, Zheng Y, Pan D. YAP-VGLL4 antagonism defines the major physiological function of the Hippo signaling effector YAP. Genes Dev. 2022 Nov-Dec 1;36(21-24):1119-1128.
[11] Moya IM, Halder G. Hippo-YAP/TAZ signalling in organ regeneration and regenerative medicine. Nat Rev Mol Cell Biol. 2019 Apr;20(4):211-226.
[12] Zeng R, Dong J. The Hippo Signaling Pathway in Drug Resistance in Cancer. Cancers (Basel). 2021 Jan 16;13(2):318.
[13] Kuser-Abali G, Alptekin A, Lewis M, Garraway IP, Cinar B. YAP1 and AR interactions contribute to the switch from androgen-dependent to castration-resistant growth in prostate cancer. Nat Commun. 2015 Sep 1;6:8126.
[14] Mia MM, Cibi DM, Abdul Ghani SAB, Song W, Tee N, Ghosh S, Mao J, Olson EN, Singh MK. YAP/TAZ deficiency reprograms macrophage phenotype and improves infarct healing and cardiac function after myocardial infarction. PLoS Biol. 2020 Dec 2;18(12):e3000941.
[15] Wehling L, Keegan L, Fernández-Palanca P, Hassan R, Ghallab A, Schmitt J, Tang Y, Le Marois M, Roessler S, Schirmacher P, Kummer U, Hengstler JG, Sahle S, Breuhahn K. Spatial modeling reveals nuclear phosphorylation and subcellular shuttling of YAP upon drug-induced liver injury. Elife. 2022 Oct 18;11:e78540.
[16] Kanai F, Marignani PA, Sarbassova D, Yagi R, Hall RA, Donowitz M, Hisaminato A, Fujiwara T, Ito Y, Cantley LC, Yaffe MB. TAZ: a novel transcriptional co-activator regulated by interactions with 14-3-3 and PDZ domain proteins. EMBO J. 2000 Dec 15;19(24):6778-91.
[17] Crosby K, Wood AW, Simendinger J, Grange C, Carr L, Costa-Grant K, Roller CJ, Polakiewicz RD. YAP vs. TAZ: differences in expression revealed through rigorous validation of target-specific monoclonal antibodies. J Histotechnol. 2020 Dec;43(4):182-195.
[18] Cao L, Zhang C, Wu Q, Bai Z, Chen J. Yes-associated protein expression is associated with poor prognosis in patients with colorectal cancer. Oncol Lett. 2021 Sep;22(3):642.
[19] Sugiura K, Mishima T, Takano S, Yoshitomi H, Furukawa K, Takayashiki T, Kuboki S, Takada M, Miyazaki M, Ohtsuka M. The Expression of Yes-Associated Protein (YAP) Maintains Putative Cancer Stemness and Is Associated with Poor Prognosis in Intrahepatic Cholangiocarcinoma. Am J Pathol. 2019 Sep;189(9):1863-1877.
[20] Jeong MG, Kim HK, Hwang ES. The essential role of TAZ in normal tissue homeostasis. Arch Pharm Res. 2021 Mar;44(3):253-262.
[21] Creasy CL, Chernoff J. Cloning and characterization of a member of the MST subfamily of Ste20-like kinases. Gene. 1995 Dec 29;167(1-2):303-6.
[22] Loforese G, Malinka T, Keogh A, Baier F, Simillion C, Montani M, Halazonetis TD, Candinas D, Stroka D. Impaired liver regeneration in aged mice can be rescued by silencing Hippo core kinases MST1 and MST2. EMBO Mol Med. 2017 Jan;9(1):46-60.
[23] Hori T, Takaori-Kondo A, Kamikubo Y, Uchiyama T. Molecular cloning of a novel human protein kinase, kpm, that is homologous to warts/lats, a Drosophila tumor suppressor. Oncogene. 2000 Jun 22;19(27):3101-9.
[24] Nishiyama Y, Hirota T, Morisaki T, Hara T, Marumoto T, Iida S, Makino K, Yamamoto H, Hiraoka T, Kitamura N, Saya H. A human homolog of Drosophila warts tumor suppressor, h-warts, localized to mitotic apparatus and specifically phosphorylated during mitosis. FEBS Lett. 1999 Oct 8;459(2):159-65.
[25] Yabuta N, Fujii T, Copeland NG, Gilbert DJ, Jenkins NA, Nishiguchi H, Endo Y, Toji S, Tanaka H, Nishimune Y, Nojima H. Structure, expression, and chromosome mapping of LATS2, a mammalian homologue of the Drosophila tumor suppressor gene lats/warts. Genomics. 2000 Jan 15;63(2):263-70.