单细胞转录组测序（scRNA-seq）是一种在单细胞水平对转录组进行测序分析的高通量测序技术，能够揭示细胞层面的基因表达差异，为研究细胞的异质性提供了有力手段。而TCR/BCR测序是一种用于分析T细胞受体（T cell receptor, TCR）和B细胞受体（B cell receptor, BCR）的高通量测序技术，可以揭示T细胞和B细胞受体的多样性和特异性，有助于解析生物体抵御病原微生物入侵的免疫机制。将scRNA-seq与TCR/BCR-seq相结合，可一次性获得大量单细胞的基因表达和免疫组库数据，从而从多个维度深入挖掘免疫细胞的奥秘。今天，我们将探讨如何利用这两种强大的技术进行深入的数据关联分析。
关联分析思路
图1 两组学关联分析思路
1）细胞亚群和克隆型鉴定
首先，通过单细胞转录组测序数据分析，我们可以识别和鉴定出不同的细胞亚群；从TCR/BCR测序数据中，我们可以鉴定出不同的克隆型信息。
2）免疫细胞亚型鉴定
接着，我们可以对免疫细胞进行再分群分析，鉴定不同的免疫细胞亚型，然后根据确定亚型的T/B细胞数据与TCR/BCR数据进行合并分析，获取每一个T/B细胞的克隆型多样性和序列信息，进而更全面地鉴定不同的免疫细胞亚群。
3）免疫细胞状态分析
在鉴定出免疫细胞亚型后，可以分析不同克隆型的T/B细胞在功能状态上的差异，如细胞激活、增殖和凋亡相关基因的表达，从而探究TCR/BCR对T细胞的表型和功能的影响，揭示免疫细胞在疾病中的作用机制。
4）基因调控机制分析
单细胞转录组测序数据可以揭示基因表达的调控网络和细胞之间的相互作用，可以将治疗前后TCR/BCR克隆型变化信息与基因调控变化信息相结合，从而更深入地探究治疗对基因表达和克隆型变化的影响。
5）功能验证
针对以上的关联分析结果，可以选取关键基因进行实验验证，如RNA干扰、过表达等验证其在免疫细胞中的作用。
应用案例
接下来根据下面两个案例带大家来看看上面的研究思路在分析中具体是怎么应用的。
案例一
在这篇基迪奥客户23年发表在Cell Reports Medicine的文章中，作者利用scRNA-seq和TCR-seq探究了放疗后肿瘤免疫微环境动态变化和机制。首先scRNA-seq鉴定了不同的免疫细胞亚群，包括单核细胞，嗜中性粒细胞，树突状细胞，T细胞，自然杀伤细胞和B细胞等（图2a）。接下来作者对T细胞和先天淋巴细胞进行了再分群分析，并基于标记基因表达和TCR特征将其分成了14个簇，包括4个CD4+ T 细胞亚群、5个CD8+ T细胞亚群和5个先天淋巴细胞亚群（图2b）。
随后，作者探究了TCR在淋巴细胞簇中的分布，发现在放疗后4天TCR克隆多样性增加（图2c、d）。然而，几乎所有T细胞亚群的克隆扩增在放疗后不久都下降了。这表明放疗可能损伤肿瘤浸润性T细胞，这限制了放疗后不久的克隆扩增。总之，在这个案例中，作者使用的是前面的第一和第二个分析思路，对免疫细胞亚型进行了鉴定并探究了他们的克隆型特征。
图2 单细胞转录组的再分群和克隆型分布[1]
案例二
在这篇22年发表在Nature Communications的文章中，作者利用scRNA-seq和TCR-seq对大颗粒淋巴细胞白血病（LGLL）患者的T细胞就行了研究。首先，使用t-SNE图揭示了患者和健康捐献者的T细胞如何在不同的TCR特异性组之间分布（图3a）。接着使用扩散图可视化T细胞表型变异，发现T细胞激活是影响CD8+ T细胞表型变化的主要因素（图3b）。扩散图显示了克隆扩增对LGLL中转录组的影响（图3c）。在患者和健康捐献者中，TCR多样性与T细胞活化呈正相关，但与TCR表达无关（图3d）。以上结果表明，在LGLL患者中，TCR的使用和激活状态对T细胞的表型和功能有重要影响，而这种影响可能与疾病的发病机制有关。
图3 TCR的使用和激活对T细胞表型的影响[2]
接着，作者进一步探究了免疫抑制治疗对LGLL患者TCR克隆性的影响（图4a），发现患者的TCR多样性降低。治疗后表达下调基因模块分析显示STAT3信号通路下调（图4b）。进一步探究了免疫激活基因、细胞周期基因（图4c）以及凋亡基因（图4d）的表达变化，发现治疗响应者的凋亡基因表达水平显著上调。这些结果表明免疫抑制治疗对LGLL患者的T细胞克隆性和基因表达有显著影响，其中包括TCR克隆性的改变和特定基因表达的调节，这些变化可能与治疗反应有关。总之，在这个案例中，作者使用了前面的第三和第四个分析思路，对免疫抑制治疗前后免疫细胞的状态和基因表达调控进行了分析。
图4 免疫抑制治疗对T细胞的影响[2]
总 结
综上所述，通过单细胞转录组测序技术与TCR/BCR测序技术的联合应用，我们能够更深入地理解免疫细胞的功能、动态变化和调控机制。这种综合分析方法不仅能揭示免疫细胞亚群的异质性，还能帮助我们更准确地识别免疫细胞的状态变化，从而评估治疗策略的效果，这为免疫相关疾病的诊断和治疗提供了新的视角和策略。
参考文献
[1] Zhang Y, Hu J, Ji K, et al. CD39 inhibition and VISTA blockade may overcome radiotherapy resistance by targeting exhausted CD8+ T cells and immunosuppressive myeloid cells[J]. Cell Reports Medicine, 2023, 4(8).
[2] Gao S, Wu Z, Arnold B, et al. Single-cell RNA sequencing coupled to TCR profiling of large granular lymphocyte leukemia T cells[J]. Nature Communications, 2022, 13(1): 1982.
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