前几期干货介绍了研究蛋白与蛋白之间互作的Co-IP、蛋白与DNA之间互作的ChIP，这些都是研究蛋白与生物大分子互作的经典且有效的方法，涉及相关实验的小伙伴可以往前几期学习下哦！依此看，蛋白质与RNA之间的互作是不是也有类似的研究方法？答案是肯定的，即RNA免疫共沉淀（RNA Binding Protein Immunoprecipitation，RIP）技术。
在原理上，RIP与ChIP非常相似，可以理解为只是研究对象不同，RIP主要是研究蛋白-RNA间的互作情况。这些RNA可以是mRNA、非编码RNA甚至病毒RNA等。在实验方案和步骤上，RIP也有自身特别需要注意的地方，后面将会一一介绍。
RIP实验可根据目的分为两种情况，一种是探索性实验，另一种是验证实验。具体讲，第一种是靶RNA未知、已知RBP的情况下，为了探寻与RBP结合的潜在RNA，一般是将RIP中分离得到的RNA进行高通量测序分析，鉴定出所有结合的RNA，并从中筛选出感兴趣的候选RNA。第二种验证性实验，则是已知靶RNA和RBP，通过qPCR对靶RNA产物进行定量、鉴定等分析。当然，可以将探索和验证视为整体的实验，即先寻找、筛选出候选RNA，接着再进一步验证候选RNA与RBP的关系。实际上，这一思路对于Co-IP和ChIP等实验方案设计是通用的。
总的来说，RIP可用于研究活细胞中RNA与蛋白的互作关系，揭示RNA的功能机制以及RBP从中起到的作用，进而参与生理或病理过程。RNA表观遗传学修饰是近年来研究的热门课题，通过RIP结合qPCR（即RIP-qPCR）可研究表遗传修饰酶与RNA之间的关系，并鉴定靶RNA的表观遗传修饰方式以及定量修饰水平，当然也可以通过WB对修饰酶（或其他RBP）进行鉴定分析。另外，RIP还可用于绘制全基因组RNA与RBP互作图谱。
RIP基本原理：
RIP在非变性条件下裂解细胞以保留蛋白-RNA之间的相互作用关系。在细胞裂解液中加入目的蛋白抗体进行孵育，然后再加入固定在磁珠、能与目的蛋白抗体特异性结合的protein A/G，通过免疫沉淀后得到‘RNA-目的蛋白-目的蛋白抗体-protein A/G-磁珠’复合物，也就是分离出细胞中目的蛋白与RNA的复合物，再进一步将沉淀复合物进行分离纯化，即可得到其中结合的RNA，最后结合qPCR或高通量测序（RIP-seq）等方法来鉴定RNA。
图1 RIP示意图[1]
RIP一般实验方案和步骤：
这里主要是总结下基本的实验过程，具体操作细节可按照所使用试剂盒的说明书执行。
（1）收集细胞并裂解
将一定密度的细胞进行常规的清洗、消化、离心收集至EP管中。如果需要用甲醛进行交联固定，则先固定后收集，操作和目的与ChIP的固定一样。接着使用新鲜配置的RIP裂解缓冲液裂解重悬细胞，置于冰上裂解5 min。注意留出少量裂解液作为对照Input。细胞裂解液可储存于-80℃数月。
（2）RNA免疫沉淀
① 重悬、制备磁珠，根据具体使用说明制备protein A/G磁珠，取一定量的磁珠于EP管中，用RIP洗涤缓冲液进行涡旋振荡后弃上清，重复2-3次；
② 将目的蛋白抗体加入细胞裂解液中，4℃摇床孵育2小时至过夜；
③ 将制备好的protein A/G磁珠加入抗体孵育后的样品中，4℃摇床孵育1小时。
（3）洗涤、纯化RNA
① 将上一步的沉淀复合物进行离心沉淀，用RIP洗涤缓冲液重悬沉淀，再离心收集，重复6次；
② 取适量蛋白酶K缓冲液重悬沉底复合物，55℃孵育30min；
③ 加入1 mL trizol以分离提取复合物中的RNA；若收集细胞时做了交联固定，此时需要先解交联后提取RNA；
④ 使用不含核酸酶的DEPC水洗脱RNA。
（4）分析鉴定
将RNA进行反转录为cDNA。若已知靶RNA，使用qPCR分析；若是靶RNA未知，则使用微阵列和测序分析。
RIP实验注意事项：
（1）最重要的一点是，RIP实验过程中所涉及的所有试剂、抗体、容器及耗材都不能含有RNA酶；
（2）实验中应该设置一个或多个阴性对照实验，以排除假阳性结果；
（3）如果需要使用甲醛交联固定，建议预实验摸索最佳的交联时间；
（4）可用于IP的抗体也可以用于RIP，抗体用量和孵育时间可能也需要摸索最佳条件；
（5）若一开始对蛋白-RNA进行交联固定，后续提取RNA前需要记得先解交联；
（6）为降低背景，应使用RIP洗涤缓冲液多次、充分洗涤免疫沉淀复合物；
（7）需确保足量的蛋白水平，目的蛋白表达水平低时，可能分离得到的RNA较少，可通过外源性过表达目的蛋白，以提高表达水平，进而获得足量的靶RNA。
（8）若是目的蛋白比较特殊还没有合适的特异性抗体，可以通过与标签融合表达，使用标签抗体进行免疫沉淀。
本期关于RIP相关内容就介绍完了，特别要注意的实验步骤是一般的实验方案参考，具体细节需小伙伴们做实验时根据自己的条件进行优化。至此，我们介绍了IP、Co-IP、ChIP、RIP这一系列的免疫沉淀技术，它们的基本原理都是基于抗原-抗体特异性结合实现的，然后根据研究对象的不同，细分出了不同的方法。除此之外，有时候我们还会见到pull-down实验，例如GST pull-down、RNA pull-down，这种又是什么实验？跟前面介绍的几种免疫沉淀又有什么联系和区别呢？下期我们继续聊聊这些问题，敬请期待。
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参考文献：
[1] Gagliardi M, Matarazzo MR. RIP: RNA Immunoprecipitation. Methods Mol Biol. 2016;1480:73-86. doi: 10.1007/978-1-4939-6380-5_7.返回搜狐，查看更多
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