Ct值是什么？
qPCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的荧光阈值时的所对应的扩增循环数（Cycle Threshold）。C代表Cycle，T代表Threshold。简单讲，Ct值就是qPCR中起始模板扩增达到一定产物量时，所对应的循环数。
为什么要有Ct值？
模板量与Ct值的关系：
在PCR指数扩增过程当中，产物量与循环数之间的关系是：扩增产物量=起始模板量×（1+En）循环个数。
Ct值的设定：
qPCR扩增产物量是以荧光信号的形式直接呈现，也就是扩增曲线。在扩增过程当中，设定一个荧光信号值，当扩增产物量达到“一定产物量”时（即达到此荧光阈值时），此时循环数定义为Ct值，需要注意的是，Ct值需要处于指数扩增时期。因此Ct值与起始模板量的关系：模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系。起始模板量浓度越高，Ct值越小；起始模板量浓度越低，Ct值越大。
Ct值的重现性
Ct值是荧光定量PCR最重要的结果呈现形式，用于基因表达量差异或基因拷贝数的结果计算。一般情况下，复孔Ct值的差值最好不超过0.05，不然表明误差结果太大，结果不可信。在PCR早期，扩增处于理想情况下，循环数较少，产物积累少，产生荧光的水平不能与荧光本底背景明显的区别；之后荧光的产生增加进入指数期，此时微小误差尚未放大，Ct值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct值是恒定的。
Ct值的范围与影响因素？
扩增效率En
PCR扩增效率是指聚合酶把待扩增基因转变生成扩增子的效率。由1个DNA分子转变生成2个DNA分子时的扩增效率为100%。扩增效率常用En表示。En是一个非常重要的参数，Ct值可不可信，需要评估En是否正常，En的正常范围为90%-110%之间，影响En的因素有很多，常见的因素如下表：
影响因素 |
解释 |
如何判定？ |
PCR抑制剂 |
模板RNA中可能含有抑制PCR反应的物质，如蛋白质或去污剂等。反转录后的cDNA中含有高浓度的模板RNA和反转录试剂成分，也可能对后续PCR存在抑制。 |
1.可通过测定A260/A280和A260/A230比值或RNA电泳，判断是否存在污染。 2.反转录后cDNA按照一定比例进行稀释。 |
引物设计不合理 |
引物不能有效退火 |
检查引物是否存在二聚体或发夹结构、存在错配；有时需注意跨内含子设计。 |
反应程序不合适 |
1.引物不能有效退火。 2.DNA聚合酶活性未充分释放， 3.长期高温，DNA聚合酶活性下降。 |
1.退火温度高于引物Tm值。 2.预变性时间太短。 3.反应程序各阶段时间过长。 |
试剂未充分混匀或移液误差 |
反应体系中，PCR反应成分的局部浓度过高或不均匀，导致PCR扩增不呈指数扩增。 |
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扩增子长度 |
扩增子长度太长，超过300bp，扩增效率低。 |
检查扩增子长度是否在80bp-300bp之间。 |
qPCR试剂的影响 |
试剂中DNA聚合酶浓度较低或Buffer中离子浓度非最优化，导致Taq酶活力未达最强。 |
标准曲线测定引物扩增效率。 |
RNA二级结构 |
RNA的完整性与二级结构会影响扩增效率 |
RNA电泳 |
Ct值的范围
Ct值的范围为15-35。但是一般建议对于不同的基因Ct范围，因起始模板量中基因拷贝数和扩增效率不同，需做出该基因的标准曲线，计算出基因的线性检测范围以及En。
Ct值异常的原因与解决方案
问题 |
可能的原因 |
解决方法 |
Ct值过大 |
1.模板浓度低或存在PCR抑制物 2.扩增效率低 |
1.提高模板浓度；或提高RNA或cDNA稀释比例；或重新制备模板。 2.降低退火温度，或选用二步法扩增；组分和体系充分混匀；优化反应程序；或尝试更换试剂。 |
Ct值过小 |
1.模板浓度高 2.NTC和NRC存在污染 3.引物设计不合适 |
1.减少模板RNA量；或更高比例稀释cDNA。 2.重新更换所有试剂；或使用UDGase防污染试剂。 3.优化程序，避免非特性扩增。 |
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