来源：小海龟科技
聚合酶链式反应（PCR），即DNA扩增法，是一种用于扩增特定DNA片段的分子生物学技术。这种技术最早是在1983年被美国的Mullis提出，并于1985年被发明。PCR技术从发明至今已有35年历史，技术发展相对成熟。
PCR技术发展至今已至第三代，经历了定性PCR技术、定量PCR技术（qPCR） 与数字PCR技术（dPCR）三个阶段。不同阶段的PCR技术的特点、应用情况与行业发展情况也不尽相同。
图1.数字PCR发展
数字PCR（Digital PCR，dPCR）是20世纪90年代末发展起来的一种核酸分子绝对定量技术。dPCR检测过程主要包括样品的分散、PCR扩增、荧光信号采集与数据分析。试验结果通过对反应单元总数和阳性反应单元数目进行统计，根据泊松分布公式计算出DNA模板分子的起始浓度，从而实现绝对定量。
图2.数字PCR操作流程
在介绍数字PCR之前，首先和大家回顾一下荧光定量PCR技术（real time PCR, qPCR）。荧光定量PCR在操作流程上包括：a.核酸分子提取；b.RNA逆转录；c.荧光定量PCR检测这三步骤。在检测原理上荧光定量PCR主要包括两种方法：a.染料法（SYBRGreen或Eva Green）；b.Taqman探针法。
数字PCR（digital PCR，dPCR）
数字PCR技术，是一种荧光定量PCR技术的升级技术。依然是利用染料法或Taqman探针法进行的荧光检测，不同的是dPCR是终点检测荧光信号，qPCR是实时检测荧光信号。而数字PCR之所以是荧光定量的升级技术，主要是利用单分子扩增实现核酸的绝对定量。数字PCR将单个DNA分子置于独立的反应室中，并对其进行PCR扩增，利用TaqMan探针法或染料法检测特定的靶序列。
数字PCR检测主要包括三步：第一，通过特定技术将PCR反应混合液分散到几万个反应单元（反应室）；第二，单分子在反应室中扩增；第三，PCR结束后检测荧光信号，最后通过泊松分布统计数数，计算出样本的拷贝数，实现核酸分子的绝对定量。与qPCR相比dPCR的绝对定量不需要利用标准曲线实现定量，而是直接可以通过单分子扩增结合泊松分布统计，既可实现绝对定量。
因此，数字PCR与荧光定量PCR不同点，主要体现在数字PCR需要进行分区后扩增，而荧光定量PCR是不需要分区扩增，而这种分区即可实现核酸分子的单分子扩增，单分子扩增既可以提高扩增效率，同时可以提高荧光检测的灵敏性和数据的可重复性。
dPCR与qPCR比较
实时荧光定量PCR可以进行相对定量，利用一系列已知浓度的标准品制作标准曲线，在相同的条件下目的基因测得的荧光信号量同标准曲线进行比较，从而得到目的基因的量，标准品可选择纯化的质粒DNA或体外合成的ssDNA等，qPCR的定量是相对标准品的定量，是一种相对定量技术。
数字PCR是基于传统PCR、实时荧光定量PCR基础上发展起来的第3代PCR技术，它不需要标准品，也不要制作标准曲线，即能实现更灵敏、更准确的绝对定量。同时，数字PCR是单分子扩增技术，能够有效避免反应抑制剂的影响。随着反应室的增加，反应受到抑制剂的影响就越小。
表1.dPCR与qPCR比较
数字PCR分区方法
数字PCR的主要核心点在于将PCR反应液分区至数万微反应单元，实现单分子扩增。不同厂家利用不同方法实现核酸分子的分区，目前数字PCR分区方法主要包括2种：微滴数字PCR(Droplet digital PCR，ddPCR)和芯片数字PCR(Chip digital PCR，cdPCR)。分别通过微液滴和微流体芯片实现分液，分隔开的每个微小区域都可进行单独的PCR反应。
1）ddPCR技术，利用油包水微滴生成技术，主要的代表是Bio-rad公司。
2）cdPCR利用微流控芯片技术将样品的制备、反应、分离和检测等集成到一块芯片上，主要的代表包括是小海龟公司的BioDigital青、BioDigital炎、SCI Digital系统。
数字PCR技术应用
数字PCR具有明显的优势，已经广泛应用于核酸检测的方方面面。肿瘤液态活检，遗传生殖检测，公共卫生检测，环境微生物检测，RNA表达检测，NGS文库定量，甲基化检测的等。
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