评论

一文了解Transwell迁移/侵袭

原标题:一文了解Transwell迁移/侵袭

Transwell:trans是转移之意,well是小室之意,合起来的意思就是穿过小室,将小室置于培养板中,小室内称为上室,培养板内称为下室,小室底层有一张通透性的膜(一般为聚碳酸酯膜),将上下层培养液分隔开。被研究的细胞被培养在上室,由于聚碳酸酯膜有通透性,下室内培养液中的成分可以影响到上室内的细胞,从而可研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响,且通过应用不同孔径和经过不同方法处理的聚碳酸酯膜,就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。

利用transwell侵袭实验可以检测肿瘤细胞的侵袭能力。未铺胶的transwell实验检测细胞的迁移能力,铺胶的transwell实验检测细胞的侵袭能力。迁移和侵袭是两个概念。迁移是指细胞的运动能力,而侵袭是细胞在运动的同时会分泌出消化ECM的蛋白,清除运动障碍,这个实验更能模拟人体内环境。

细胞迁移是细胞在外界信号(如:趋化因子)的作用下从一个区域转移到另一区域的运动。这个过程在在生理和病理学方面都发挥着重要的作用,比如损伤修复、细胞分化、恶性肿瘤转移、免疫细胞的迁移、组织修复等。

细胞侵袭与细胞迁移比较类似,但是“侵袭”需要细胞穿过胞外基质层(ECM)或基底膜基质层(BME),在这个过程中细胞先酶解去除ECM/BME的阻碍,从而在趋化因子浓度梯度驱使下完成从一处到另一处的移动。

实验步骤

1.基质胶的准备:4℃隔夜解冻Matrigengel,实验前转移到冰盒中;将提前准备好的冰放置冰盒中,凝胶前的操作均在冰上操作。将枪头、离心管与放有Transwell小室的24孔板放入冰盒预冷,并用预冷枪头将Matrigengel混匀。

2.基质胶铺板:稀释Matrigengel,按Matrigenge和无血清培养基以1:8的比例进行稀释;将稀释后的Matrigengel,垂直加入Transwewll上室中,均匀平铺在底部;放入培养箱(37℃,5%CO2)中3h,使Matrigengel聚合成凝胶薄膜。将上室中多余液体吸掉,在每孔中加入无血清培养基,再置于培养箱30min,进行基底膜水化。

3.制作细胞悬液:制作细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12-24h,进一步去除血清的影响(此步骤可选择操作);取汇合度达70%-80%的细胞进行消化,终止消化后将弃废液离心,接着用无血清培养基重悬细胞,调整细胞密度至2.5×105/mL。

4.接种细胞:在24孔板下室加入500µL含10%FBS培养基。然后用镊子将Transwell小室置于24孔板内(注意:下层培养液和小室间经常会有气泡产生,一旦产生气泡,下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了,在种板的时候要特别留心,一旦出现气泡,要将小室提起,去除气泡,再将小室放进培养板);每孔加入200µL细胞悬液到Transwell上室;培养箱培养24h后可进行固定染色。(时间点可根据肿瘤细胞侵袭能力而定,一般24-48h,还需要考虑细胞状态和消化时间对细胞的影响。)

5.结果统计:用0.1%结晶紫染色5-10min,PBS洗3遍,除去未与细胞结合的结晶紫,用棉签轻轻擦拭小室的上侧,将非特异性结合于小室上表面的染料擦掉,以便后续镜检;适当风干后,在400倍显微镜下选取5个视野观察细胞并计数。

返回搜狐,查看更多

责任编辑:

平台声明:该文观点仅代表作者本人,搜狐号系信息发布平台,搜狐仅提供信息存储空间服务。
阅读 ()
大家都在看
推荐阅读