今天给大家分享一篇在Neuron期刊上发表题目是Single CellPro filesofRetinal Ganglion CellsDif feringinResi iencetoIn juryRevea lNeuro protec tiveGenes（视网膜神经节细胞的单细胞图谱损伤恢复力的差异揭示了神经保护基因）文章，下面我们跟随文献解读进行进一步学习。
研究背景
对中枢神经系统 （CNS） 的损害，无论是急性（例如创伤性损伤）还是慢性（例如神经退行性疾病），通常都会导致不可逆的损害。一些神经元死亡，那些存活下来的神经元通常无法长出新的轴突并重建突触连接。
这些现象的一个共同但知之甚少的特征是，即使致病性损伤被广泛共享，特定的神经元类型也会受到不成比例的影响。
研究内容
见图一
scRNA-seq揭示成年小鼠中45种分子不同的RGC类型。
图一
（A）RGC（绿色）位于视网膜的最内层，即神经节细胞层（GCL）。它们的轴突捆绑在一起形成视神经。IPL，内层丛状层;GCL，神经节细胞层。
（B）不同RGC类型的树突在IPL的下层（S）1-5内具有不同的层压模式，这决定了它们对突触前伴侣的选择。这里说明了几个RGC子类和类型的刻板形态。INL，内核层。
（C）35，699只成年小鼠RGC的转录异质性的t分布随机邻居嵌入（t-SNE）可视化。细胞由聚类分配着色，使用图聚类确定。聚类按频率递减的顺序进行编号。
（D）RGC簇C1-45的相对频率（平均±SD，n = 10个重复）。与已知类型或子类匹配的聚类将被标记。
（E）点图显示了数据中RGC和非RGC簇中不同视网膜类别的标记基因（行）的表达模式（列;见颜色条，顶部和右侧）。每个圆圈的大小与表达基因的细胞的百分比成正比，颜色表示表达细胞中的平均标准化转录本计数。GABA-AC和Gly-AC，GABA能和甘氨酸能无碱细胞;HC，水平细胞;BC，双极细胞;公关，光感受器;内皮细胞。
（F） 点图显示唯一标记 RGC 簇（列）的基因组合（行）。单个基因的表示形式如（E），此处归一化为1。2 或 3 标记代码始终涉及标记 A 的存在，以及标记 B 和 C 的存在（例如 A+B+ 或 A+B+C+）或不存在（例如 A+B-或 A+B-C+）。 在这种情况下，圆圈的大小表示满足表达模式的细胞的百分比，颜色表示细胞中阳性标记的平均转录本计数， 对于每个组合，归一化为 1。
（G）放线菌素D（ActD）处理的（y轴）和图谱（x轴）视网膜之间的RGC型频率高度相似。
（H）点图显示基因组合，这些基因组合在名义对照中唯一定义每种RGC类型（如F），并保存在ActD处理的视网膜中。行和列顺序如 （F） 所示。
（I） 显示紧密对应关系的散点图（R皮尔森= 0.93），在scRNA-seq（y轴）与IHC（x轴）发现的RGC组的相对频率之间。
见图二
scRNA-seq簇与RGC类型的对应关系。
图二
（A）通过在YFP-H系（绿色）中稀疏标记的RGC上结合FISH（洋红色）和IHC来表征新型RGC类型。图中显示了分别表达 Gpr2（左）和 Fam4a10（中）的 S24/S88 层压 C19 和 C4 RGC 的示例，以及表达 Slc5a25（右）的 S17 层压 C7 RGC （右）。IPL片下层基于CALB1或CALB2染色（白色虚线）绘制。“C25”面板中的合并显示较高增益的标记细胞，以揭示树突形态。
（B至G）点图突出显示子类中 RGC 类型之间的转录差异。虚线将先前描述的标记（上图）与本研究中确定的新标记物（下图）分开。（B） αRGC 类型。（C） T-RGC类型。（D） F-RGC类型。（E） ipRGC类型。（F） S2/S4 层压 RGC 类型。（G）包含D / V-ooDSGC的C16可以分为Calb1+（假定的D-ooDSGCs）和Calb1--（假定的V-ooDSGCs）细胞。
（H）与（G）中的解释一致，标记V-ooDSGC的Hb9小鼠系中的GFP+细胞是CALB1--和CALB2+（洋红色）。
（I） 点图显示了基于液滴的 scRNA-seq 图谱（红色）和来自 FACS 分类的 W3 RGC（绿色）的基于板的数据中检测到的 W3 类型（行）之间 DE 基因表达的一致模式。按图集聚类 ID 标记。
（J）可视化为树状图的RGC簇的转录相关性揭示了RGC类型的子类（注释栏，底部）。点图显示了簇（列）中关键亚类富集或定义基因（行）的表达。
见图三
在ONC之后对RGC进行scRNA-seq分析。
图三
（A）在ONC之前和之后的六次收集的RGC上进行scRNA-seq。每个时间点收集了8，456–13，619个RGC。
（B） iGraphBoost程序的一个步骤的说明，用于对在时间t收集的RGC进行分类N+1基于前一个时间点 t 的 RGC 类型图集n.该程序由 Atlas RGC 在 t 处启动0.在步骤 1 中，梯度提升树在 t 上训练nRGC 类型用于对 t 进行分类N+1研究资助委员会。仅应用高置信度分配，并且在此阶段大量 RGC 仍未分类。在步骤 2 中，基于所有 t 构建的 Jaccard 加权 k 最近邻图N+1RGC 用于使用步骤 1 中的分类 RGC 作为锚点，通过最近邻投票将标签传播到未分配的 RGC。成功分类 tN+1RGC 用于对 t 进行分类N+2下一次迭代中的 RGC。
（C） 在 ONC（x 轴）之后的每个时间点可以自信地分配给类型 （y 轴） 的 RGC 分数。与iGraphBoost（黑色）相比，使用图谱RGC作为训练数据的“一步法”方法（灰色）导致晚期受伤RGC中分配细胞的比例显着降低。
（D）点图显示唯一定义每种RGC类型的基因组合（如图1F中的行和列顺序）在iGraphBoost分配的14dpc中保持，尽管观察到某些标记的表达水平降低。
（E） RGC 类型特定弹性在 14dpc 相对于对照 （Ctrl） 秩排序基于 14dpc 与 Ctrl 处相对频率比的递减值排序。RGC 类型在 14dpc 时表现出广泛的生存范围，范围从 1% 到 98%。
（F） 14d生存排名（如E所示），由RGC子类着色。重叠的子类由双色调色条表示。
（G）14d生存排名（如E）由对照中的相对丰度着色。
（H） 散点图显示由scRNA-seq和IHC确定的RGC组的14dpc存活率之间的对应关系（R皮尔森= 0.97）。使用26种抗体和转基因系的组合（表S3）覆盖宽频率范围的RGC类型标记组。
（I）本研究中由IHC确定的RBPMS的RGC体细胞损失（钻石;参见图S4F示例图像）或通过上丘体的逆行标记（三角形;从Galindo-Romero等人重新绘制，2011年）。
（J-M）每种RGC类型都可以根据细胞随时间变化的损失模式分配给三个生存组之一。显示的是相对存活的单个图表，定义为每个时间点存活的细胞比例，适用于7种弹性类型（J），11种中间类型（K）和27种易感类型（L）（另见图S3G）。采样频率的波动导致罕见RGC类型（频率<1.2%）的相对生存值>0至5dpc（死亡很少）。
（J–L） 中的单个类型不包括误差线，以便清晰显示。灰线，生存组中每种类型的相对生存率;彩色线，表示跨类型的相对生存;带阴影的色带，跨类型相对生存值的标准偏差。通过2dpc观察到的波动在预期误差（彩色丝带）内，与后来的时间点相反。实线，表示生存组中不同类型的相对生存率;着色色带，标准偏差。组均值叠加在 （M） 中。
见图四
弹性和易感RGC的生理特征。
图四
（A） 32dpc 和 1dpc 网状植入视网膜中 14 个通道中的两个通道的代表性记录。
（B） 在多天内记录的每个通道（行）中表示的每个通道（行）的两个单独 RGC 的排序尖峰波形。Ch1显示了1dpc和3dpc上两个排序的RGC（紫色和绿色线）的尖峰波形;细胞在8DPC时死亡。Ch2显示了1dpc和3dpc上两个排序的RGC（蓝色和红色）的波形，但在8dpc上仍然只能检测到一个RGC。
（C） 方向选择性 （DS）、定向选择性 （OS） 以及方向选择性和方向选择性 （NS） RGC 对沿 8 个方向移动的光栅的响应的极坐标图。每个图显示同一单元格在不同日期的测量值。
（D） 每个回复类别（列）中按响应类型划分的 RGC 比例为 1dpc。S，持续;T，瞬态;开、关和开/关可响应光增量、递减或两者兼而有之。
（E）与未压碎对照相比，ONC（黑线）后生理记录中的RGC存活率是时间的函数（虚线显示从Hong等人，2018年重新绘制的数据）。
（F）经生理学评估，持续RGC比瞬时RGC存活得更好（∗p < 0.03 通过费舍尔精确检验）。
（G） OSGC比DSGC或NSGC更容易受到影响（∗p < 0.04 通过费舍尔精确检验）。
（H） 在 OS 或 NS 的 RGC 中，开关单元比 ON 或 OFF 单元更敏感（∗p < 0.03 通过费舍尔精确检验）。
（I）在DSGCs中，ON-OFF细胞（ooDSGCs）比ON或OFF电池更易感（根据Fisher's Exact Test在0dpc时p = 06.14）。
（J）存活到14dpc或死亡8dpc的RGC的平均射速。
（K）被5dpc杀死的RGC在1和3dpc之间的发射速率几乎没有变化。
（L）被5dpc杀死的RGC在1和3dpc之间的方向/方向选择性指数（DSI/OSI）变化很小。
（M）弹性RGC（αOFF-S，C42）在Ctrl，4，7和14dpc处的面形态。
（N）C42形态复杂性（总分支点）和大小（树突面积）的量化显示，两种测量的时间点之间没有显着差异（单因素方差分析与事后Tukey HSD检验）。数据显示为平均值±SD。
（O）在Ctrl，45和3dpc处敏感RGC（αOFF-T，C4）的面部形态。O' 显示了 Ctrl 和 4dpc 处树突的放大视图。
（P）C45形态复杂性的量化，如（N）所示。∗p < 0.04;单因素方差分析与事后 Tukey HSD 测试。数据显示为平均值±SD。
见图五
损伤后基因表达的全球变化。
图五
（A）显示ONC后时间变异的基因热图。每个基因（行）的表达值在给定时间点（列）在所有RGC上取平均值，然后在绘制之前跨时间进行z评分。黑条根据时间动力学将基因分成8个模块（Mod）。
（B）模块1中与轴突和神经元功能相关的基因本体（GO）生物过程相关的单个基因（系）的平均时间动态。基因和选择它们的GO过程列于表S4中。
（C）如（B）所示，模块5和6与细胞凋亡或各种应激途径相关的GO生物过程相关基因。
（D）绘制的每种RGC类型（系）的（B）基因的表达动力学。蓝线对应于 ipRGC 类型（C31、22、40 和 33）。对每种类型的表达式值进行 z 评分以跟踪相对变化。
（E）与（D）相同，但来自（C）的基因。
（F） DE基因（行）的表达模式，基于未受伤视网膜中的7dpc存活率来区分10种resRGC类型和14种最易感的RGC类型（列）（图3F）。在绘制之前，沿每行对值进行 z 评分。
（G-J）在resRGC或susRGC类型（系）中选择性上调的候选基因的平均时间动态。蓝线对应于7种resRGC类型，包括上调Ucn（C42，43）或Nppb（C22，31，33，40，43）（左图）的类型，这些类型未针对Tac1或Cidea富集
见图六
影响RGC存活的基因。
图六
（A）UCN在持续的αRGCs（α-RGC-S;C42和43）和Crhbp选择性地表达在susRGC类型（C14，15，17，24，26，28和39）的子集中。小提琴图显示了指示聚类在 0 和 7dpc 处的合并表达式。小提琴上方的数字表示每个子集中表达标记的细胞的百分比。箱线图描绘了中位数和四分位数间距。
（B）视网膜切片的FISH在Spp7 + RGC（α-RGCs标记）中显示1dpc处的UCN上调：白色圆圈。Crhbp在ONC之前和之后的一组Spp1-RGC（非α-RGC）中表示：绿色圆圈。
（C）RBPMS视网膜整体支架中的IHC显示，在OE-Ucn，KO-Crhbp或注射UCN蛋白后，RGC在14dpc的存活率增加。
（D）Timp2在ONC前后的弹性ipRGC（C22，31，33，40和43）中选择性表达。Mmp12在粉碎后在广泛的susRGC亚群（C7，8，11，12，14，17，18，23，24，27，28，43，37，39和41）中上调，但在scRNA-seq数据中的ipRGC较低。小提琴图如（A）所示。
（E） 视网膜切片的 FISH，如 （B） 所示。
（F） 视网膜整体安装中的 IHC，如 （C） 所示。
（G）在Ndnf（C0，7和22）和Prph（C31和43）的31和43dpc处的resRGC子集中的表达。小提琴图如图（A）所示。
（H） 视网膜切片的 FISH，如 （B） 所示。
（I）视网膜整体安装的IHC，如（C）所示。
（J）在（C），（F）和（I）所示的干预措施之后，整个支架的总RGC存活率（RBPMS+细胞;平均±SEM）。红线和色带，四组对照的平均RBPMS密度±SEM平均值，这些对照彼此之间没有显着差异：无注射，PBS，UCN载体和MMP12抑制剂载体。n = 18;STAR方法和图S8F中的详细信息。∗p < 0.05（邦弗罗尼调整）。
（K）与载体相比，IHC显示OE-UCN和OE-Timp14在2dpc的CARTPT + RGC（圆圈）存活率增加。顶行，CARTPT+ RGC 在 0dpc。
（L）IHC定量显示CARTPT + RGC（C12，14，16和36）与NEUROD2 RGC（C12，19，20，25，26，29，35和39）在14dpc的选择性存活率。y 轴，每节 RGC #positive 14dpc/控制。通过视神经对视网膜矢状面进行。+∗p < 0.05（罗斯福调整后）。
见图七
促进RGC轴突再生的基因。
图七
（A）体内OE和KO。携带OE基因或KO sgRNA的AAV2在粉碎前14天玻璃体内注射。在12dpc再生轴突通过CTB647注射顺行标记。UCN蛋白以2dpc注射。
（B）清除视神经的最大投影，显示载体注射或指示的UCN（OE或蛋白质）和KO-Crhbp（g14和g1）治疗后2dpc处的顺行标记RGC轴突。
（C）与（B）相同，但在OE-Timp2和KO-Mmp9（g1和g2）之后。
（d） 与（b）相同，但遵循OE-Ndnf和OE-PRPH。
（E–G）轴突再生的定量。对照线代表三组的平均±SEM，彼此之间没有显着差异：仅PBS，UCN载体和没有sgRNA的AAV-Cre;n = 14;STAR方法和图S8G中的详细信息。∗p < 0.05，使用数值积分评估曲线下面积的双尾学生t检验。对单个距离进行邦弗朗尼校正的混合效应分析如表S6所示。
在（B）–（D）中，比例尺，250 μm;X，粉碎部位;红线，距破碎现场 500、1，000 和 1，500 μm 的距离。
研究结论
我们生成了成年小鼠RGC类型的图谱，并将其用作跟踪特定类型损伤反应的基础。我们确定了RGC类型之间的一系列弹性，并记录了变性前的转录组，生理和形态变化。然后，我们操纵在弹性或脆弱类型中选择性表达的基因，发现一些促进ONC后RGC存活和轴突再生的基因。
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