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引物设计是 qPCR 非常重要的环节。 今天小编给大家推荐 2 款简单实用的在线 qPCR 引物设计网站，让你分分钟搞定 qPCR 引物！
Primer3 Plus
严格的 qPCR 引物设计一般要求其中一条引物要跨外显子，最好在 3' 端设计引物，产物的长度在 300bp 以内等。本在线软件可满足 qPCR 引物设计的要求。
Primer bank
哈佛大学的一个 qPCR 引物数据库，目前有超过 20 万条引物，涵盖了人和小鼠大部分已知的基因。根据网站上对两万多对引物的验证结果，引物有效率为 82.7%。尽量选择这种验证过的 qPCR 引物，qPCR 品质比较有保障。
「进阶」
引物设计验证与优化
引物设计完成之后，需要用软件进行分析，找到最佳的引物对，采用 Blast分析验证引物，可以知道序列的正确性，也能知道引物的特异性状况、引物的具体位置以及 PCR 产物的大小。
如果仅仅是为了验证引物序列是否正确（仅适合于基于完全匹配原则设计的引物），也可以用 Blast 的「Nucleotide-nucleotide BLAST (blastn )」 或「Search for short, nearly exact matches」搜索，具体方法为：
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