Hi，大家好，我是小Q
上一期，我们讲到Treg细胞的分选方法，包括磁珠分选CD4+CD25+Treg细胞和流式分选CD4+CD25+CD127 lo/-Treg细胞，相信大家对Treg细胞的制备有了初步的概念。
首先邀请大家复习《Treg—被肿瘤绑架的叛徒》 《 Treg细胞的分选方法 》 中的两个知识点：第一，经典的Treg细胞标志是CD4+ CD25+Foxp3+T [1]。
Treg细胞根据来源大致分为两类：一类是由胸腺分化发育而来的自然性Treg细胞 (Natural Treg, nTreg)，另外一类是由初始CD4+T细胞（Naïve CD4+T）经抗原刺激后分化发育而来诱导性 Treg细胞（Induced Treg, iTreg）, iTreg也是肿瘤微环境中主要的Treg细胞亚群。
那么问题来了：
1纯度问题：磁珠分选CD4+CD25+Treg细胞或流式分选CD4+CD25+CD127 lo/-Treg细胞，两种分选方法都避开了Treg最特异性的标签—核内转录因子Foxp3。
2得率问题：小鼠脾脏中Treg细胞的占比不足10%，想要获取足够量的细胞，就要牺牲不少的小鼠和分选试剂。
3表型问题：从健康小鼠脾脏分选得到的Treg细胞大部分是nTreg，如果我们想要研究Naïve CD4+T向iTreg的分化过程，该如何操作呢？
本期推文，针对上述三大困惑，给大家带来Treg细胞的体外诱导分化方案。
01
Treg细胞体外诱导分化的流程
图 1 iTreg细胞体外诱导分化流程 [2]
iTreg的祖先是Naïve CD4+T细胞，我们首先采用磁珠分选，从小鼠脾脏单细胞中把这群Naïve CD4+T细胞选拔出来。
初来乍到的Naïve CD4+T细胞还很稚嫩，需要双信号（Annti-CD3和Anti-CD28）的激活，才能成为充满生存力和好奇心的成熟CD4+ CD25+T细胞，这群细胞可以指数增殖（1变2，2变4，4变8……），增殖过程需要细胞因子IL-2的帮助。最后，Foxp3的表达是CD4+ CD25+T成为Treg的最关键一步，TGFβ1是推动这一神奇转变的“大Boss”[3]。
02
Treg细胞体外诱导分化的步骤
2.1 Anti-mouse CD3 预包被
试剂：PBS缓冲液；LEAF TMPurified anti-mouse CD3（Biolegend，货号：100223）。
耗材：48孔平底细胞培养板。
仪器：超净工作台，4℃冰箱。
实验步骤（在超净工作台中操作）：
(1) 在1ml PBS缓冲液中加入LEAFTMPurified anti-mouse CD3 4μl，终浓度4μg/ml，0.5ml/孔加入到48孔平底细胞培养板中。
(2) 4℃冰箱包被过夜，使LEAFTMPurified anti-mouse CD3结合在平底细胞培养板的板底。
2.2 制备小鼠脾脏单细胞悬液
做一盘水饺，馅料应该用白菜猪肉还是韭菜鸡蛋，锅具应该用炒锅还是蒸锅，不同的厨师有自己的习惯。同样，制备脾脏单细胞悬液，不同的科研人有自己的操作步骤。 上期推文《 Treg细胞的分选方法》 中， Cherry给大家分享了她制备小鼠脾脏单细胞的步骤，今天也来分享一下小Q制备脾脏单细胞的步骤。
动物：6-8周龄雌性C57BL/6小鼠
试剂：75%酒精；MACS® Separation Buffer (Miltenyi Biotec, 货号：130-091-221)。
耗材：6cm培养皿，泡沫板（充当简易版手术台），无菌镊子，无菌手术剪刀，50ml无菌离心管，70µm孔径细胞筛网（BD Biosciences，货号：352350），5ml注射器，流式管。
仪器：超净工作台，离心机。
实验步骤（在超净工作台中操作）：
(3)在6cm培养皿中加入5ml MACS® Separation Buffer，准备无菌手术器械、手术台。
(4)采用CO2窒息位法处死小鼠，在75% 酒精中浸泡消毒后，右侧卧于手术台上。
(5)从小鼠左侧背腹部依次剪开皮肤、腹膜，剥离小鼠脾脏，置于含有MACS® Separation Buffer的6cm培养皿中。
(6)准备20ml MACS® Separation Buffer，将70μm孔径细胞筛网放置在50ml离心管上，用2ml MACS® Separation Buffer润洗筛网。
(7)无菌镊子夹取脾脏放入70μm孔径细胞筛网中，采用5ml 注射器活塞轻轻研磨小鼠脾脏，使分散的单个细胞穿过细胞筛网，加MACS® Separation Buffer冲洗。重复“研磨-冲洗”步骤至脾脏组织完全分散为单细胞。
(8)离心管中的细胞悬液，再过一遍70μm孔径细胞筛网，即获得脾脏单细胞悬液。
(9)取200μl细胞悬液于流式管中，4℃保存，后续用于分选纯度测定。
2.3 磁珠分选小鼠Naïve CD4+T细胞
试剂：EasySep™ Mouse Naïve CD4 +T Cell Isolation Kit (STEMCELL, 货号：19765)；MACS® Separation Buffer。
耗材：5ml无菌离心管（STEMCELL, 货号：38007）。
仪器：超净工作台，涡旋震荡仪，计时器，EasySep™ Magnet (STEMCELL, 货号：18000)。
实验步骤（在超净工作台中操作）：
(10)脾脏单细胞悬液350g离心6min，弃上清。每个脾脏的细胞用1ml MACS® Separation Buffer重悬，细胞密度约为1×108/ml。
(11)在细胞悬液中加入大鼠血清50μl/(1ml细胞悬液)，用移液枪轻柔吹打混匀。
(12) 将细胞悬液转入5 mL无菌流式管，尽量不要使细胞悬液挂壁。
(13) 在细胞悬液中加入Isolation Cocktail 50μl/(1ml细胞悬液)，轻轻吹打混匀，室温孵育7.5分钟。
(14) 在细胞悬液中加入Depletion Cocktail 50μl/(1ml细胞悬液)，轻轻吹打混匀，室温孵育2.5分钟。
(15) 涡旋震荡RapidSpheres™，30 seconds，使磁珠均匀分散。在细胞悬液中加入磁珠RapidSpheres™，75μl/(1ml细胞悬液)，轻轻吹匀，室温孵育2.5分钟。
(16) 添加MACS® Separation Buffer，使细胞悬液总体积为2.5ml，用移液枪轻轻上下吹打2 - 3次混匀。
(17) 将样品管（不带盖）插入磁铁，室温孵育2.5分钟。
(18) 拿起磁铁，将流式管中的细胞悬浮液倒入新的5ml无菌离心管中，即获得Naïve CD4+T细胞。
(19) 2支流式管中分别取200μl细胞悬液，4℃保存，第1支用于分选纯度测定，第2支用于Treg表型测定（诱导分化前）。
2.3 活化Naïve CD4+T并诱导为iTreg细胞
试剂：淋巴细胞培养液LCM（Lymphocyte culture medium），即500ml RPMI 1640培养基中加入50ml 胎牛血清，50μM β-巯基乙醇，5ml青霉素-链霉素双抗（100×）；PBS缓冲液；LEAF TMPurified anti-mouse CD28（Biolegend，货号：102112）；Murine IL-2（Peprotech，货号：212-12）；TGFβ1（R&D，货号：7666-MB-005）。
耗材：48孔平底细胞培养板；24孔平底细胞培养板。
仪器：超净工作台，细胞计数仪，CO 2细胞培养箱。
实验步骤（在超净工作台中操作）：
(20) Naïve CD4+T细胞悬液，400g离心6分钟，弃上清，用1 ml淋巴细胞培养液LCM重悬。
(21) 取20μl细胞悬液计数，根据经验，细胞总数约为1.6×106，细胞浓度约为1.6 ×106/ml。
(22) Naïve CD4+T细胞悬液中，加入anti-CD28 antibody，浓度为2μg/ml。
(23) Naïve CD4+T细胞悬液中，再加入Murine IL-2，终浓度为20ng/ml。
(24) Naïve CD4+T细胞悬液平均分为2份，每份约0.5ml，其中一份加入TGFβ1，终浓度为5ng/ml。
(25) 48孔平底细胞培养板，吸弃anti-CD3 antibody预包被溶液，每个孔用0.5ml PBS洗一遍。2个孔每孔分别加入一份0.5ml Naïve CD4+T细胞悬液（约0.8 ×106细胞）。
(26) 37℃，5% CO2培养5天，第3天补加0.5ml淋巴细胞培养液及细胞因子IL-2（20ng/ml）、TGFβ1（5ng/ml），并将48孔细胞培养板中的细胞转入24孔细胞培养板中。
2.4 流式鉴定Naïve CD4+T细胞
（CD4 + CD44 low CD62L high ） 的纯度
试剂：流式抗体Anti-Mouse CD4 Antibody, Clone RM4-5 (Invitrogen，货号：17-0042-81) ，Anti-mouse CD44 antibody, clone 5035-41.1D （Invitrogen，货号：MA1-81231）和Anti-Mouse CD62L (L-Selectin) Antibody, Clone MEL-14 （Invitrogen，货号：12-0621-81）；MACS® Separation Buffer。
耗材：流式管。
仪器：流式细胞仪。
实验步骤：
(27) 分选前预留的脾脏单细胞悬液和分选后预留的Naïve CD4+T细胞悬液，采用流式细胞术，检测Naïve CD4+T细胞 (CD4+CD44lowCD62Lhigh)的分选效率。
(28) 在每根流式管中加入0.625 µlAnti-Mouse CD4 Antibody, 10 µl Anti-Mouse CD44 Antibody, 0.625 µl Anti-Mouse CD62L Antibody，室温避光孵育20分钟。
(29) 在每根流式管中加入1ml MACS® Separation Buffer，400g离心6min，倒弃上清。
(30) 在每根流式管中加入300 µlMACS® Separation Buffer重悬细胞，上机检测Naïve CD4+T细胞 (CD4+CD44lowCD62Lhigh)表型。
图 2 Naive CD4+T表型鉴定
https://www.stemcell.com/easysep-mouse-naive-cd4-t-cell-isolation-kit.html
详细的操作介绍完了，那么开篇时候的困惑解决了吗？
1纯度问题：虽然小Q给大家展示的STEMCELL官网的Data，但是小Q可以负负责任的告诉大家，这个Data是经过小Q复现的。
从图2中可以看出，分选前，CD4+T细胞占脾脏细胞的20%，CD44lowCD62Lhigh Naïve细胞占CD4+T细胞的73%；分选后，CD4+T细胞占脾脏细胞的98%，CD44lowCD62Lhigh Naïve细胞占CD4+T细胞的97%；
也就是说，Naïve CD4+T细胞 (CD4+CD44lowCD62Lhigh)的纯度从15%提高到了95%，可以说STEMCELL的分选试剂盒还是很强大了。
细心的小伙伴肯定要问，我们更加关心的是，这些纯纯的Naïve CD4+T细胞在细胞培养箱中增殖分化5天以以后，CD4+CD25+Foxp3+ 的Treg细胞纯度有多高？这个问题咱们下期细说。
2得率问题：小鼠脾脏中Treg细胞的占比确实不多，但你这1×10 8脾脏分选过后不也才得到约2.0 × 10 6Naïve CD4+T细胞，也挺低的呀。
大家别急，当这些纯纯的Naïve CD4+T细胞在细胞培养箱中欢乐5天以后，奇迹就会发生，Naïve CD4+T会快速的增殖获得很多的Treg细胞。
3表型问题：Treg细胞的体外诱导分化方案，允许我们在实验室里面模拟观察Naïve CD4+T向iTreg的分化过程，你尽可以让你想到的东西（化合物、元素、抗体、细胞因子……）参与其中，看看会发生怎样的故事。
想知道更多Treg相关实验技术的小伙伴们，一定要持续关注君莲数据库哦~
参考文献
[1] F. Shan, A. Somasundaram, T.C. Bruno, C.J. Workman, D.A.A. Vignali, Therapeutic targeting of regulatory T cells in cancer, Trends Cancer 8(11) (2022) 944-961.
[2] M.C. Fantini, S. Dominitzki, A. Rizzo, M.F. Neurath, C. Becker, In vitro generation of CD4+ CD25+ regulatory cells from murine naive T cells, Nat Protoc 2(7) (2007) 1789-94.
[3] J.M. Moreau, M. Velegraki, C. Bolyard, M.D. Rosenblum, Z. Li, Transforming growth factor-beta1 in regulatory T cell biology, Sci Immunol 7(69) (2022) eabi4613.
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撰文 丨小Q老师
审核丨小张老师
责编丨小张老师
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